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【报告】靓果安药剂对番茄和烟草抗病相关基因的诱导表达分析
发布于:2017-1-13 13:04:52 点击量: TAG:靓果安,基因诱导,抗病基因,中药杀菌,试验报告

 

实验人:         刘欢  赵磊         

  位:  西北农林科技大学 植保学院 

  期:         2016.12              

一、      实验目的

通过喷雾和灌根处理,明确靓果安药剂对番茄和烟草抗病相关基因的诱导表达情况。

二、      原理

一些抗病菌活性物质本身不能直接作用病菌,不能钝化病菌或者抑制病菌的复制与增殖,但是可以诱导植物产生抗病性。病菌侵染寄主植物时,寄主植物通过细胞表面的识别原件快速的识别病菌,使植物体内发生一系列反应,诱导植物体内产生新的物质阻止病菌的入侵,这就是植物的抗病反应。这种抗病反应可以被无机盐、有机小分子、生物大分子等刺激诱导产生。这类抗病菌活性物质从根本上提高了寄主的抗病菌能力,由治疗病菌实现了预防病菌,比如聚丙烯酸、乙烯利(Ethrel)、阿斯匹林、水杨酸和苯甲酸都有诱导植物抗病性的作用。进一步的研究发现,被成功诱导表现出抗病性的寄主内总伴有大量的 PR 蛋白或者水杨酸的产生 ( 1)。实验证实 NS-83、褐藻胶、板蓝根、病毒唑、DHTDA-DHT E30 在烟草和甜菜上都诱导产生了一些 PR-P。但是不同的植物源活性物质诱导产生的 PR-P 的种类和含量上有一定的差异;并且同一种植物源活性物质在不同植物上诱导产生 PR-P 的种类和含量上也有一定的差异。

图 1植物的系统获得抗病性

1植物的系统获得抗病性

三、      实验步骤

实验共设计3组处理分析:(1)靓果安200倍液喷雾处理;(2)靓果安200倍液灌根处理;(3)空白对照,每组分别处理3株番茄和烟草幼苗,分别在处理完成后 0 h6 h12 h24 h36 h48 h, 72 h后采集叶片,测定 PR-1 基因和PR-5基因表达量的变化。

RNA提取方法

准备工作:研钵-40℃预冷1小时,离心机4℃预冷,异丙醇-40℃预冷,RNA抽提液65℃预热。

1.   在通风厨中向1.5 mL无酶离心管中依次加入250 ul氯仿异戊醇(氯仿:异戊醇=24:1),250 ul水饱和酚(取下层,避光处理),500 ul 65℃预热的RNA抽提液,做好标记,置于冰上待用;

2.   用液氮再次预冷研钵,并向研钵中加入样品开始研磨,大约研磨35次,取适量置于1.5 mL无酶离心管中,立即剧烈震荡混匀,常温放置大约5 min

3.   冷冻离心机4℃1200rpm/min离心10 min

4.   分两次取上清液,每次200 ul转移到含250 ul水饱和酚和250 ul氯仿的新离心管中,轻轻颠倒混匀;

5.   冷冻离心机4℃1200rpm/min离心10 min

6.   分两次取上清液,每次100 ul转移到新离心管中,加入200 ul预冷的异丙醇,轻轻颠倒混匀;

7.   -20℃沉淀2 h以上或-40℃沉淀1 h以上;

8.   4℃1200rpm/min离心10 min

9.   加入200 ul 70%乙醇洗沉淀,4℃1200rpm/min离心5 min,弃上清液;

10. 重复步骤9

11. 微离心,用10 ul枪头吸取残留的上清液(避免触碰沉淀),置于超净工作台,风干5 min

12.  加入3050 ul DEPC水使RNA沉淀充分溶解约30 min后,保存于-80℃冰箱备用或直接用于下游实验。

引物设计

参照胡宗利等《番茄 PR-1 PR-5 基因的表达特性分析》论文报道的番茄 PR-1 PR-5基因的引物序列和蔡学建等《2%宁南霉素水剂对烟草花叶病毒的抑制及作用机制的初步研究》论文报道的烟草PR-1 PR-5基因的引物序列。引物序列如下:

番茄:

内参基因:5'-CCTCCGTTGTGATGTAACTG-3'

5'-ATTGGTGGAAAGTAACATCATC-3'

PR-1基因:5'-TACGCCAATCAAAGAGC-3'

5'-TTCCCAAGTCACATAAGCA-3'

PR-5基因:5'-TGTGACTTACACTTATGGTTCCG-3'

5'-GTTGTTTCATTGTGAGTAGAGCC-3'

烟草:

内参基因:5'-GACATGAAGGAGGAGCTTGC-3' 5'-ATCATGGATGGCTGGAAGAG-3'

PR-1基因:5'-CAATACGGCGAAAACCTAGCTGA-3' 5'-CCTAGCACATCCAACACGAA-3'

PR-5基因:5'-GCTTCCCCTTTTATGCCTTC-3' 5'-CCTGGGTTCACGTTAATGCT-3'

反转录合成cDNA

25 ul体系

模板RNA

5.0 ul

DEPC

4.0 ul

下游引物 (10 umol/L)

1.0 ul

Total

10.0 ul

短暂离心,70金属浴5 min,置于冰上降温后,依次加入

DEPC

3.5 ul

10×M-MLV Buffer

5.0 ul

10 mmol/L dNTPs

5.0 ul

M-MLV(200 U/ul)

1.0 ul

RiboLock RNase Inhibitor(40 U/ul)

 0.5 ul

Total

15 ul

短暂离心后,37金属浴1 h95灭活10 min,取出RT产物。

PR-1PR-5基因表达量分析

实验共设计3个处理:(1靓果安200倍液喷雾处理;(2靓果安200倍液灌根处理;(3空白对照。每个处理重复5株,分别在处理完成后0 h6 h12 h24 h36 h48 h, 72 h后采集叶片,测定PR-1基因和PR-5基因表达量的变化。

Real-time PCR反应体系

25 ul反应体系:

cDNA

2 µL

2×SYBR Green I

12.5 µL

上游引物

1 µL

下游引物

1 µL

DDW

8.5 µL

总体积

25 µL

四、      实验结果

靓果安200倍液对番茄PR-1PR-5基因表达量影响

PR基因是植物诱导抗病性的重要标记基因之一,在植物抵抗病原微生物方面更起着重要作用。本实验借助PR-1PR-5基因特异的实时荧光定量RT-PCR体系,定量分析了靓果安200倍液处理番茄和烟草后PR-1PR-5基因的表达情况。

番茄和烟草中PR-1基因在喷药6 h后开始被诱导表达,PR-1基因表达量在24 h达到高峰,番茄PR-1表达量为对照组的2.37(2),烟草PR-1表达量为对照组的1.92(3)PR-1基因表达量从24 h开始下降,之后到72 h恢复到正常水平。灌根处理的番茄和烟草叶片和喷雾处理组表达特征较为一致,表达量达到高峰时,番茄PR-1基因的表达量为对照组的2.42倍,烟草PR-1基因的表达量为对照组的1.77

靓果安200倍液处理番茄后PR-1基因的表达情况

2 靓果安200倍液处理番茄后PR-1基因的表达情况

靓果安200倍液处理烟草后PR-1基因的表达情况

3 靓果安200倍液处理烟草后PR-1基因的表达情况

 

PR-5基因表达特征和PR-1具有相似性,喷雾处理后6 h后开始被诱导表达,表达量达到高峰时, 喷雾处理番茄PR-5基因表达量为对照组的1.37倍,灌根处理后表达量为对照组番茄的1.58(4)。喷雾处理烟草PR-5基因表达量为对照组的1.44倍,灌根处理后表达量为对照组烟草的1.38(5)PR-5基因表达量从24 h开始下将,同样到72 h恢复到正常水平。

靓果安200倍液处理番茄后PR-5基因的表达情况

4靓果安200倍液处理番茄后PR-5基因的表达情况

靓果安200倍液处理烟草后PR-5基因的表达情况

5靓果安200倍液处理烟草后PR-5基因的表达情况

 

靓果安药剂可诱导番茄和烟草产生抗病性。很多植物在病原物入侵时可以通过识别病原物的致病因子激活自身的免疫系统,使自身抗病相关基因迅速上调,阻止病原物入侵,最终表现出对病原物的抗病性。植物的这种自反抗病性除了特异识别病原物的致病因子而激发外,还可以被诱导产生系统获得抗病性(SAR)。植物SAR的产生往往伴随着一些指示基因的上调表达(PR基因)或者水杨酸(SA)的合成。比如SA就是SAR的信号传递过程中的重要介体,在植物与病原物互作过程中起着重要作用,是SAR产生的重要生理指标。然而SA在植物体内含量比较低,精确测量植物体内SA含量在的变化比较困难。PR-1基因是SA的指示基因,因此通过测量PR-1表达量的变化可以从侧面反映SA含量的变化。本实验采用相对实时荧光定量的方法定量分析了靓果安200倍液处理后的番茄和烟草相关抗病基因表达量的情况。实验结果表明靓果安200倍液处理6 h后,PR-1PR-5基因开始上调表达,在处理24 h后,PR基因表达量达到最高值,之后到72小时恢复到正常水平。

 

从本实验结果来看,靓果安200倍液对番茄和烟草PR-1PR-5基因表达量有一定影响,可以诱导PR-1PR-5基因上调表达,提高番茄和烟草的抗病性。